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【成果】博士后梁志梳在國際期刊Chemosphere發表學術論文
2019-07-31 09:00   審核人:   (閱讀)

研究院梁志梳博士后、李桂英教授、安太成教授和熊舉坤副教授等人在國際期刊Chemosphere(IF2018= 5.108)發表了題為“Purification, molecular characterization and metabolic mechanism of an aerobic tetrabromobisphenol A dehalogenase, a key enzyme of halorespiration in Ochrobactrum sp. T”的學術論文c07彩票网平台。

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論文摘要

由于環境污染物如四溴雙酚A(TBBPA)等的生物降解作用因細菌而異,并且強烈依賴于這些細菌所表達的特定降解酶,因此為了更好的將這些細菌應用于環境污染物原位修復,非常有必要對其降解TBBPA的分子機理進行探索。在前期研究中,我們成功分離純化出了一株具有同時高效脫溴和有氧礦化TBBPA能力的菌株Ochrobactrum sp. T, 但是到目前為止,對于TBBPA生物降解分子機理的研究還未見報道。本研究通過構建具有TBBPA降解能力的重組菌,并采用一系列純化方法對TBBPA降解酶進行了分離純化,并同時考察了該降解酶降解TBBPA的分子機理c07彩票网平台。結果表明,該降解酶(命名為溴酚脫鹵素酶)的分子量為117 kDa,Km為26.6 μM,Vmax為0.133 μM min-1 mg-1。它是目前唯一一個被純化出來具有TBBPA降解能力(去除率為78%)的脫鹵素酶。電子供體NADPH或甲基紫精的加入可以提高脫鹵酶的活性。而且重組菌與野生菌的粗酶液底物譜非常相似,表明該重組酶可能時負責TBBPA降解的關鍵酶。通過鑒定的3種中間產物,提出了脫鹵酶在有氧條件下去除TBBPA的機理。這不僅有利于加深我們對TBBPA生物強化降解分子機制的認識,并且有助于環保相關部門開發出更有效修復被TBBPA污染的環境的策略c07彩票网平台。

 

主要內容

為了更有效的對TBBPA污染的環境進行生物修復,本研究的主要目的是從TBBPA的降解菌中分離和純化出一個具有TBBPA脫溴能力的降解酶,并評估影響該脫鹵素酶代謝活性的環境因素。通過對TBBPA降解酶的編碼基因進行克隆和表達c07彩票网平台c07彩票网平台,獲得了一株具有TBBPA降解功能的重組菌。經超聲破壁和蛋白純化樹脂(Ni-NTA His-Bind resin)處理后,成功的對該脫鹵酶進行了純化,并借助超高效液相色譜系統與三重四極桿質譜聯用儀對該脫鹵酶降解TBBPA的中間產物進行了探究,提出了該酶降解TBBPA的機理。實驗的主要流程見圖1c07彩票网平台。

         

圖1 TBBPA脫鹵酶的分離純化、鑒定和分子機理研究的示意圖

 

通過研究不同亞細胞組分對TBBPA的去除效率(圖2),發現重組菌的細胞懸浮液對6 mg L-1的TBBPA去除率為85%,而無細胞的提取液在240min內也可降解78% TBBPAc07彩票网平台,表明脫鹵酶主要存在于細胞質中。

         

 圖2 不同亞細胞組分對TBBPA脫溴作用

Fig. 2. Debromination of TBBPA by different subcellular fractions of (a) recombinant strain and (b) wild strain T.

選擇鎳離子親和層析對粗酶液進行分離純化,發現經純化后該脫鹵酶被純化了10.2倍數,比活力從0.3增加到了3.06c07彩票网平台,回收率為58.5%。從圖3可以看出,該脫鹵酶的大小為117 kDa,與鹵代酸脫鹵酶相似度達到了100%,是一種新型脫鹵酶,我們將其命名為溴酚脫鹵酶。

 

圖3 TBBPA 脫鹵酶的SDS-PAGE圖

Fig. 3. SDS-PAGE analysis of the purified bromophenol dehalogenase from recombinant strain. Lane M: protein marker; Lane 1: protein extract of control strain E. coli pET30a (+); Lane 2: protein extract of recombinant strain; Lane 3: purified bromophenol dehalogenase.

 

從圖4可以看出NADPH可以顯著提高TBBPA脫鹵酶的活性c07彩票网平台,這可能是因為NADPH可以為酶分解TBBPA的氧化呼吸鏈提供遞氫體,此外,甲基紫精也可以加快脫鹵酶分解TBBPA,表明甲基紫精也可以作為TBBPA脫鹵反應的電子供體。脫鹵酶具有很寬的底物譜c07彩票网平台,可以分解2,4,6-三溴苯酚(TBP),2,6-二溴苯酚(2,6-DBP),4-溴苯酚(4-BP), 4-溴二苯醚和4,4-二溴二苯醚等一系列溴代化合物c07彩票网平台。這些酶學特性為脫鹵酶在原位修復中的進一步應用提供了重要的依據。

 

 

圖4 不同添加劑對溴酚脫鹵酶的影響

Fig. 4. The effect of different additives on the activity of bromophenol dehalogenase from recombinant strain. The data is represented as the mean?±?standard deviation for triplicate incubations.

 

對脫鹵酶降解TBBPA的代謝中間產物進行分析發現,在最初的60 min,以4-丙烯基-2,6-二溴苯酚為主,隨著反應的進行,TBP和4,4-二溴二苯醚的濃度逐漸的升高c07彩票网平台c07彩票网平台,到180 min,4,4-二溴二苯醚的濃度達到最大。隨著反應時間從60 min 增加到 240 minc07彩票网平台,溴離子濃度也從16.7增加到37.7μM(圖5)。根據上述的鑒定的中間產物,我們提出了脫溴酶降解TBBPA的機理為:在有氧的條件下,TBBPA首先被氧化形成了4-丙烯基-2,6-二溴苯酚和2,6-DBP,然后4-丙烯基-2,6-二溴苯酚被轉化成TBP,隨后在脫鹵酶的作用下經4-BP迅速的轉化成4,4-二溴二苯醚,最后脫溴生產二苯醚。

 

圖5 TBBPA代謝中間產物生產濃度變化曲線

Fig. 5. Evolution curves of TBBPA biodegradation brominated intermediates by purified enzyme.

 

論文總結

通過構建具有TBBPA降解功能的重組菌,對TBBPA降解酶進行了純化和鑒定并對其降解機理進行了考察。經過一系列的純化步驟我們純化了一個具有高效降解TBBPA的脫鹵酶c07彩票网平台,這是目前唯一一個被純化出來具有TBBPA降解能力(去除率為78%)的酶,我們將其命名為溴酚脫鹵酶。當以TBBPA為底物時,Km為26.6 μM,Vmax為0.133 μM min-1 mg-1,NADPH和甲基紫精的加入可以加速TBBPA的降解,且該脫鹵酶還可以同時降解包括2,6-DBP,4,4-二溴二苯醚c07彩票网平台,4-溴二苯醚等溴代底物。這將為今后典型溴代酚類阻燃劑的生物降解提供新的思路和依據c07彩票网平台。

論文鏈接

https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.124461

 

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